微反应槽PCR芯片阵列温度控制系统

点击：1934 日期：[ 2014-04-26 21:39:32 ]

微反应槽PCR芯片阵列温度控制系统李现明张玉林杨东营 (山东大学控制学院,山东济南250061) 摘　要：设计了内部不含传感元件、加热元件的低成本微反应槽聚合酶链式反应(PCR)芯片,研制了宏观集中控制与微观分散控制有机结合的PCR芯片阵列温度控制系统。宏观集中控制装置以水为媒质通过特制换热器给芯片提供聚合酶链式反应所需的基本温度;在柔性印刷电路板上形成与芯片阵列对应的微型加热器阵列,针对各芯片进行分散的温度补偿。采用串级控制获得微加热器阵列与换热器之间的良好配合,实现各芯片准确、快速的温度控制。关键词：聚合酶链式反应;微机电系统;工业控制计算机;串级控制中图分类号：TN405;TP212.11　　　文献标识码：A 文章编号：1004-2474(2007)02-0243-04 聚合酶链式反应(PCR)是体外快速扩增特异性DNA片断的酶学方法,广泛应用于分子生物学的各个领域。其基本原理是在体外用一对与待扩增的DNA片断两侧序列互补的引物诱发聚合反应,该链DNA先经高温(95℃)中变性,然后在低温(55℃)与引物退火,再在中温(72℃)中进行延伸。此过程反复循环进行,一般需20~40次,特异性DNA数量获得指数规律的倍增,便于进一步对DNA分子进行检测、分析。目前分子生物学实验室使用的是台式PCR扩增仪,但台式PCR扩增仪的升降温速率低(1℃/s),所需时间长,而且存在温度测控精度低、均匀性差、各个循环周期之间重复性差等不足。随着微机电系统(MEMS)技术的兴起,建立在半导体和微细加工技术基础上的PCR芯片已成为研究热点,可从本质上弥补台式PCR扩增仪的上述不足,且节省样品。PCR芯片有连续流动式PCR芯片(又称空域式PCR芯片)[1]和微反应槽PCR芯片(又称时域式PCR芯片[2]、批量式PCR芯片)两个大类[3]。微反应槽PCR芯片可分为两种,一种是芯片内部含加热器、传感器[4-5],另一种是芯片本身不含加热器、传感器,由外部宏观的温控装置对其实施PCR温度循环控制[6-7]。前者从本质上解决了宏观温度参数的大惯性、大滞后问题,但芯片结构复杂,生产工序多,生产成本高,成品率低,芯片价格高,且一般每次只能扩增一个或几个样品,难以大范围替代台式PCR扩增仪。后者PCR芯片结构简单,生产工艺简单,生产成本低,提高了芯片的成品率和可靠性,但由于外部温控装置的大惯性、大滞后仍存在,且一般每次也只能扩增一个或几个样品,故其与常规台式PCR扩增仪相比无明显优势。本文作者以新的技术方案形成新型测控系统,使多片本身不含加热器、传感器的低成本微反应槽PCR芯片同时受到精确、快速的温度控制。 1·系统方案设计如图1所示,若干PCR芯片放置在一个特殊设计的换热器上表面,形成阵列;换热器以纯净水为媒质,由循环泵、电磁阀控制,根据需要流过相应温度的纯净水;系统含有四个储水箱,其中三个储水箱内设置温度传感器和电热管,将其温度分别控制在与PCR三个特征温度相对应的温度上。第四个水箱内为冷却水(试验过程中为冰水混合物),用于加快从高温变性到低温退火的降温过程;对于每个微反应槽PCR芯片设置一个微加热单元,以便对各个PCR芯片提供精确、快速的温度控制。各微加热单元制作在同一张柔性印制板上。根据精度要求和换热器表面温度的实际均匀性,将换热器上表面进行合理分区,认为每个小区域的温度是相同的,称其为等温区,并且认为在有关微加热器受到同样电加热功率的前提下等温区内各芯片温度相同。在每个等温区中选择位于中间的PCR芯片作为测控样板芯片,在其微槽中设置一支微型热电偶并充满蒸馏水,而该等温区其余PCR芯片内部不设置温度传感器。测控样板芯片内不进行聚合酶链式反应,聚合酶链式反应在其余芯片内完成。当进行不同类型或不同批次的聚合酶链式反应时,只需更换其余芯片,不需更换测控样板芯片;柔性印制板上与每个测控样板芯片所对应的微加热单元内同时制作一个热电阻温度传感器,以便采用串级控制策略,形成性能良好的温度随动系统。由测控样板芯片反馈信号所得到的控制输出同时作用于该等温区的其余PCR芯片上,于是可认为该等温区所有PCR芯片温度与样板芯片温度相同;测控样板芯片可视为测控系统的固有配置。测控样板芯片概念的提出,不仅简化了芯片测温传感器的配置和与之相应的某些操作,而且由于它们是测控系统的固定配置,从而使人们有条件对其精确标定。 2·低成本微反应槽PCR芯片及基于柔性PCB板的微加热器及传感器阵列设计微反应槽PCR芯片如图2所示。其基片为具有良好导热性能的硅材料,且其热导率可高达1.57 W/(cm·℃)。在基片上制作两个相同的蛇形微槽,其尺寸为宽1 200μm,深200μm,长105 mm,容积各为25μL。蛇形微槽有利于反应液的加载、卸载和芯片的清洗。在盖片相应位置上制作4个直径 1 mm的小孔,作为反应液加载、卸载的出入口。利用毛细管原理进行反应液的加载,利用压缩空气进行反应液的卸载,在聚合酶链式反应过程中芯片进出口用石蜡油密封。上述芯片微细加工过程:5.08 cm硅片用热氧化方法形成1μm的氧化层,然后用紫外光曝光光刻和HF在氧化层上形成微反应槽,再用KOH各向异性湿法腐蚀法在硅片上腐蚀出200μm深的微反应槽。在0.6 mm厚PYREX玻璃盖片上用YH-D4030型激光雕刻机于相应位置打进出口孔。基片、盖片图形对准,在400℃、800 V下进行阳极键合,形成微反应槽PCR芯片。柔性PCB板采用软性基材制成,其主要特点是可弯曲折叠,已广泛应用于各类电子设备中。采用与换热器上表面几何尺寸相对应的一张单面柔性PCB板,基于PCB板铜箔的电阻率与温度有确定关系的原理,在PCB板与各个测控样板芯片所对应的位置制作微加热及传感单元,如图3所示。图3中每个微加热及传感单元含一个微加热元件、一个微传感元件。在PCB板与其余芯片所对应的位置仅制作相同的微加热元件。形成微加热元件、微传感元件的铜箔横截面宽55μm、厚35μm。在20℃时每个微加热元件阻值约3.5Ω,每个微传感元件阻值约为7.0Ω。由于目前有成熟的柔性PCB板生产技术,各微加热元件、微传感元件的一致性能够得到充分保证。将柔性PCB板安置在PCR芯片阵列的上方并与PCR芯片相接触,提供针对各芯片的温度校正。使用弹性元件和导热绝缘胶,保证柔性PCB板上各微加热及传感单元与各PCR芯片之间具有良好、均匀的热接触,将各接触热阻的分散性限制在允许范围内。 3·温度控制系统硬件配置图4为温度控制装置。在3个储水箱内各设置500 W电加热丝和K型热电偶温度传感器,由PC总线工业控制计算机将其温度分别控制在与PCR反应进程高温变性、低温退火、中温延伸三个特征温度相对应的温度上。计算机根据PCR反应进程的需要,通过接口板卡,不断的控制8个电磁阀,使相应水箱的水通过换热器进行循环,换热器表面温度迅速接近芯片所需温度,约1~2℃的差额由各芯片的微型加热器补充。由于各微型加热器只需提供1~2℃的温升,因此芯片温度控制的精确性、快速性较易实现。以测控样板芯片内液体温度测量值为反馈信号,每个等温区形成一个独立的控制回路。换热器是系统的一个关键器件,其换热速率应与PCR芯片的热传导时间常数相适应,且要有较好的温度均匀性,为此特制专用换热器。换热器上表面为放置PCR芯片的有效换热面,采用热导率高的紫铜材料,而且设计了扩展换热面以提高其换热速率。为减小热量损失,确保换热速率,换热器的其余部分采用热导率低的塑料材料。流体在换热器中的有效路径长约2 m,宽约60 mm。经红外线热像仪检测,换热器表面升温速率可达12℃/s,降温速率可达10℃/s。根据其动态温度分布将换热器表面划分为12个温区,经反复试验每个温区内的温度极差可确保小于0.5℃。在各奇数编号温区的流体入口处设K型热电偶温度传感器一只,它在测出该温区流体入口温度的同时也测出了上一个温区(偶数编号)的流体出口温度。每个温区换热器上表面可装设10只PCR芯片,则总共可设置120只PCR芯片,其中12只为测控样板芯片,108只为实际进行PCR反应的芯片。 4 ·芯片阵列温度控制策略系统共有12个PCR芯片温度控制回路。对于每个控制回路的各个PCR芯片,存在两个控制输入,第一个为水温经换热器、硅基片再到反应液,它由计算机根据PCR进程控制泵、阀自动形成;第二个为电功率经柔性PCB板上的微型加热器、玻璃盖片、硅基片再到反应液。升温过程中PCR芯片所需能量的大部分由换热器提供,微型加热器提供热量仅起"校正"及"拾遗补缺"的作用;降温过程中PCR芯片储存的能量基本从换热器再经水散发。对于每一只PCR芯片,实际上第一个输入可测但不可控,只有第二个输入可控,但第二个输入又必须与第一个输入相适应、相协调。如何科学合理的实现两种控制作用的协调是一个关键问题。因此,在控制策略的处理上,人为的将此双输入系统看成是单输入系统,但芯片的温度给定信号由第一个控制输入与PCR进程共同产生,应用串级控制策略[8]对芯片进行PCR温度控制。每个等温区的控制方框图如图5所示。图5中,给定信号发生器、主回路控制器、副回路控制器、PWM发生器等皆由计算机通过软件实现。系统的控制目标是各等温区芯片温度要"快、准、稳"的跟踪其给定温度。建立控制对象的数学模型是确定控制算法的基础,因此,采用机理建模与实验建模相结合的方法建立其数学模型。首先采用机理建模方法确定模型结构,再用实验方法确定模型参数。由于微加热器与芯片之间的接触热阻、换热器与芯片之间的接触热阻皆远大于芯片内部热阻,因此可采用集总参数近似建模。从副回路控制器输出到微加热器与芯片之间界面温度的传递函数结构取为含纯滞后的惯性环节,即: 式中　T1为时间常数,是微加热器及其与芯片之间热阻、热容的综合反映;τ1为滞后时间,主要由微加热器与芯片交界面热传输滞后造成;K1为微加热器电功率与界面温度之间的静态放大系数。从微加热器与芯片间界面温度到芯片样品温度的传递函数结构亦取为含纯滞后的惯性环节,其时间常数T2为芯片自身热惯性和样品热惯性的综合反映。滞后时间τ2包括芯片玻璃盖片的热传输滞后、样品的热传输滞后和样品温度的检测滞后(芯片硅结构部分的传输滞后为毫秒级,可忽略)。经阶跃响应法[8]测试,T1=0.5 s,T2=3.1 s,τ1=0.1 s,τ2=1.1 s。据此,可确定主、副控制器的结构和大致参数,主、副控制器的参数最终要靠现场整定。内环时间常数、时滞都很小,工作速度快,形成对主控制器输出信号的快速跟踪,使芯片上表面温度迅速达到所需值;能快速消除进入副环的各种扰动,且对芯片上表面接触热阻的波动体现较强的鲁棒性。芯片下表面是芯片热能的主要传输界面,其对芯片的影响最终体现在芯片内部液体温度的变化上,这种变化与给定信号的变化趋势一致,分担了串级控制系统外环的绝大部分任务。换热器到芯片的热能传输与微加热器到芯片的热能传输在时间上是并行的,保证了系统的快速响应。芯片温度的最终准确控制由串级控制系统的外环完成。 5·结束语系统按95℃变性5 s、55℃退火5 s、72℃延伸20 s运行时,每个温度循环周期约为40 s,升降温过程中芯片内部液体温度的最大超调量在0.7℃内,各循环周期芯片内部液体温度重复性在0.7℃内,72℃延伸温度稳态误差在0.5℃内,满足PCR反应的要求。据已有报道,依靠外部温控装置对内部不含加热器、传感器的PCR芯片进行温度控制,其最大升温速率为4℃/s,最大降温速率为2.2℃/s,30个热循环需30 min;本系统升温速率可达12℃/s,降温速率为10℃/s,可在20 min内完成30个热循环。本系统可同时实现108个PCR芯片共计216个样品的扩增,这种多芯片群控方式是本系统的特色。对该系统形成的PCR产物的检测,完全能与现行的技术、设备接轨,有利于其推广。参考文献: [1]章春笋,徐进良.连续流动式PCR芯片相关技术研究进展[J].分析测试学报,2004, 23 (6):114-118. [2]章春笋,徐进良.时域式PCR生物芯片中温度动力学研究进展[J].现代科学仪器,2005, 22(3):13-17. [3] (美)森图里亚(Senturia,S.D.)著.刘泽文译.微系统设计[M].北京:电子工业出版社,2004:403-417. [4]何文波,闫卫平,郭吉洪.PCR生物芯片微加工技术的研究[J].仪表技术与传感器,2003, 40(1):10-13. [5]刘大震,闫卫平,郭吉洪,等.PCR生物芯片微反应腔的制作及其热分析[J].微纳电子技术,2003,40(7):321-323. [6]邹志青,周　天,赵建龙,等.硅-玻璃聚合酶链式反应微芯片对β-葡糖苷酸基因的扩增[J].生物化学与生物物理进展, 2004, 31(1):41-45. [7] LIN Yu-cheng, HUANG Ming-yuan. A rapid micro-polymerase chain reaction system for hepatitis C virusamplification [J].Sensors and Actuators B, 2000, 71(9):2-8. [8]王树青.工业过程控制过程[M].北京:化学工业出版社,2003:69-80.

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